1. 당 성분(가용성고형물, 환원당) * TM = 효모 무첨가, YM =효모 첨가

• 막걸리 발효기간별 가용성 고형분은 많은 연구에서 당도로 사용. 따라서, 본 연구에서도 가용성 고형분을 당도로 표현
• 발효성 당 분석 기준으로 설정한 HPLC 분석 결과와 가장 유사하다고 보고된 DNS법으로 환원당을 측정
• 측정 결과 가용성 고형분 함량이 환원당보다 높은 값을 나타내었으며, 당생성능은 TM이 YM보다 높음
• 1일차에 급격한 상승 후 감소하는 점에서 동일한 경향을 보이는데 이는 초기에 효모가 당을 소모하는 양에 비해 효소에 의해 생성되는 양이 더 많았으나, 이후 효모에 의해 알코올이 생성되어 당의 양이 감소한 것으로 판단됨
• 현재 영세규모 업체에서 적용하고 있는 굴절계를 이용한 가용성 고형분(그림1)값은 환원당(그림2)의 값과 큰 차이를 나타냄
• 따라서, 술 덧 발효 관리를 위해 발효성 당을 분석할 때 주의가 필요

2. 산 (pH, 총산)

• TM, YM 모두 pH는 무첨가구에서 발효 초기 급격하게 감소한 반면, 효모 첨가구에서는 pH가 서서히 감소하는 양상
• 아미노산 함량은 발효 경과에 따라 증가하는 경향이며, 2단 담금 이후 0.07∼0.31 g/100 mL 수준으로 두 시험구간 비슷
• 발효가 진행되면서 술덧 중의 효모, 젖산균 등의 발효로 생성되는 각종 유기산에 의해 증가하는데, 발효 0-3일에 총산 함량의 증가폭은 효모 첨가구에서 낮았고, 약 15.4, 3.7배의 증가율을 보여 3일에 각각 1.08, 0.48%로 나타남
• 총산 함량은 2단 담금으로 급격히 감소하고 이후부터 31일까지 무첨가구가 0.40∼0.66%, 효모 첨가구는 0.19∼0.46%의 수준을 나타냄
• 이러한 결과로 발효 초기에 증가된 총산 함량은 발효 종료 시점까지도 영향을 주는 것으로 사료됨
• 발효 초기, 무첨가구의 높은 총산 함량은 발효 1-2일의 주요 우점종인 bacteria에 기인한 것으로 확인되며, 발효 후기에는 발효 7일 이후 증가한 bacteria, 그중에서도 분포율이 급격히 증가하고 20일의 주요 우점종인 Lactobacillus plantarum이 총산 증가에 많은 영향을 준 것으로 판단됨

3. 알코올, 아미노산도

• 막걸리는 발효제의 효소에 의해 전분질이 당화되고 당화된 포도당이 효모에 의해 알코올로 전환되는 병행복발효 과정으로 당 함량과 알코올 함량과의 상관성이 큼
• 알코올은 발효 1일차에 YM이 TM보다 더 높은 함량을 보였고, 이는 효모 첨가로 인해 YM에서는 분해된 당을 소비하여 알코올발효가 일어나는 과정이 더 빠르게 진행된 것으로 판단
• 막걸리 발효기간별 아미노산도는 원료 쌀에 함유된 단백질의 분해와 발효 후반 효모의 자가분해에 의해서 주로 생성되는데 전반적으로 효모를 첨가하지 않은 처리구에서 더 높은 값을 나타냈음
• 아미노산은 발효과정 중 효모의 대사에 의하여 고급알코올(fusel oil)로 변환되어 주류의 향기를 부여하기도 하는데, 발효 초기 효모를 첨가한 YM의 경우 TM보다 아미노산도가 낮은 것으로 보아 효모에 의한 대사과정을 거쳐 다른 물질로 변환되었기 때문으로 판단됨

1. 유기산

그림1. 막걸리 발효 중 유기산 변화

• 유기산은 탁주에서 산미성분으로 청량한 맛이나 새콤한 맛과 신진대사를 원활히 하여 몸속의 피로물질을 제거하며 술의 맛과 향, 산도를 조정하는 역할
• Lactic acid와 acetic acid 함량이 과다하면 탁주가 시어질 수 있기 때문에 유기산 조성이 중요한 요인
• Acetic acid의 증가는 알코올의 산화로 인한 초산발효의 진행이며, 품질저하의 큰 요인
• 분석된 유기산은 총 7종으로 그 중 propionic acid, formic acid는 거의 검출
• 무첨가구의 주요 유기산은 lactic acid, succinic acid, acetic acid 순으로 확인
• 효모 첨가구는 malic acid를 포함한 4종이 검출
• 총 유기산 함량은 발효 경과에 따라 증가하는 경향으로 그 중 lactic acid가 가장 비중이 높으며, 증가폭은 효모 첨가구에서 낮게 나타남
• 발효 초기 높은 알코올 농도로 인해 젖산 생성 bacteria의 생육이 억제되어 lactic acid 함량의 증가폭이 낮게 나타난 것으로 사료
• Lactic acid이 적절하게 있으면 잡균에 의한 식품의 부패를 막아주는 역할을 하지만 과다하면 술이 시어질 수 있으므로 주의가 필요

2. 유리당

그림2. 막걸리 발효 중 유리당 변화

• 무첨가구에서 주로 glycerol, glucose, sucrose이 확인
• 효모 첨가구는 fructose를 포함한 4종이 확인
• 총 유리당 함량은 발효 초기 무첨가구에서 매우 높게 나타남
• 발효초기에 전분 분해가 이루어졌으나, 알코올발효 효모의 개체수가 부족하여 효모 첨가구보다 당 소모율이 낮았던 것으로 판단
• Glucose 함량이 14일까지 효모첨가구에서 낮게 나타남
• 이는 glucose가 미생물의 영양원이나 효모의 알코올 발효 기질로서 이용률이 높았던 것으로 판단
• 2단 담금 이후 glycerol함량은 증가하는 경향이며, 효모 첨가구에서 높게 나타남
• Glycerol은 효모의 대사산물로서 glucose로부터 생성되며 포도주를 부드럽게 하여 목넘김을 좋게 하며, 쓴맛과 산미를 완화
• 따라서, 효모 첨가구의 높은 glycerol 함량은 쓴맛을 감소시키고 감미에 영향을 줄 것으로 판단

미생물

• 미생물에는 1) 세균류, 2) 진균류 포함
• 막걸리, 약주의 경우, 미생물 군집이 목, 과, 속, 종 4개 그래프 포함
• 누룩의 경우, 미생물군집 그래프가 목, 과, 속 3개 나열

1. 세균류

그림1. 재래누룩, 효모첨가 막걸리의 발효기간 중 세균 군집의 조성 변화

• 막걸리의 발효 과정에서 fungi 군집의 조성변화를 생물 분류로 나누어 Figure 1에 나타냄
• fungi species의 분포율 변화를 상대적인 비율로 나타낸 결과는 Table 1에 나타냄
• 공통적으로 발효경과 전체에 걸쳐 목(order) 수준에서 Saccharomycetales가 99% 이상 분포
• 그 중에서 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속이 포함
• 효모 첨가구에서는 발효가 시작되면서 Saccharomyces cerevisiae가 우점
• 무첨가구 발효 0일에 각각 17.3, 7.2%의 분포율을 보인 누룩에서 유래된 효모 Wickerhamomyces anomalus와 Pichia fermentans는 발효 시작 후 분포율 감소
• Choi 등(2019)의 연구에서 재래누룩에서 분리 동정한 Wickerhamomyces anomalus의 경우 기존의 시판 효모와 비교하여도 높은 알코올 발효능을 가지는 것으로 보고됨
• Wickerhamomyces anomalus 는 시판효모와 비슷한 알코올 내성이 있지만, 술 덧 내에 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속에 의한 생육 저해 가능성이 있음
• 이외에도 알코올 함량의 증가에 따른 S. cerevisiae의 저항성 증가와 함께 기인하여 분포율이 감소한 것으로 판단
• Saccharomyces cerevisiae의 경우 포도당이나 과당 등 단당류를 대사하여 알코올을 생성하지만 전분질을 분해할 수 없는 특징을 가짐
• Saccharomycopsis fibuligera는 누룩에서 분리되며 glucoamylase, α-amylase와 같은 전분분해효소를 분비하고 에탄올을 생산할 수 있는 효모로 알려짐
• 따라서 재래누룩 막걸리는 발효가 시작되기 전에는 당분이 없어 Saccharomycopsis fibuligera에 의해 전분 분해가 이루어진 후 Saccharomyces cerevisiae가 증식하여 알코올 생성이 이루어진 것으로 판단

2. 진균류

• 공통적으로 발효 경과 전체에 걸쳐 목(Order) 수준에서 Saccharomycetales가 99% 이상 분포되어 있었고 그 중에서 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속이 포함되어 있었음
• 효모 첨가구에서는 발효가 시작되면서 첨가한 Saccharomyces cerevisiae가 우점하였고, 무첨가구 발효 0일에 각각 17.3, 7.2%의 분포율을 보인 Wickerhamomyces anomalus와 Pichia fermentans는 누룩에서 유래된 효모로 발효가 시작되면서 분포율이 감소됨
• 무첨가구의 발효 0-3일에는 Saccharomycopsis fibuligera가 우점하였으나 2단 담금 이후 Saccharomyces cerevisiae의 분포율이 급격히 증가되는 경향이며 71.6∼92.1% 수준으로 나타남
• Wickerhamomyces anomalus의 경우, 술덧 내에 Saccharomyces 속, Saccharomycopsis 속에 의한 생육 저해 가능성 이외에도 알코올 함량의 증가에 따른 S. cerevisiae의 저항성 증가와 함께 기인하여 분포율이 감소한 것으로 판단됨
• Pichia 속은 이취의 원인이 될 수 있는 산막효모로서 산소 요구도가 높기 때문에 막걸리 술덧의 발효 과정 중 미생물의 호흡에 의해 용존산소량이 감소되어 생육이 저해되었거나, 알코올 발효력이 우수한 Saccharomyces 속의 영향으로 생육이 저해된 것으로 판단

1. 당

• 약주 중에 존재하는 당류는 환원당과 비환원당으로 나눌 수 있으며, 모두를 합하여 총당이라 한다. 이러한 당은 약주 발효 중 존재하는 미생물 생장에 필요한 영양원으로 이용되어 알코올 생성에 관여하게 된다.
• 1일차까지는 쌀알누룩을 사용하여 증가하였으나, 2일차부터는 감소하였는데 알코올 함량이 높아진 것으로 보아, 효모에 의해 이용되었음을 알 수 있다. 반면, 6일 이후부터는 가용성고형분, 환원당 모두 증가하는데 당으로 분해는 되었지만 효모가 이용하지 못한 것으로 보인다. 따라서 이 방법으로 술을 빚는다면 단맛이 나는 술 제조가 가능할 것으로 판단된다.

2. 산

• 약주 발효 초기에 높은 산이 존재할 경우, 유해균의 번식을 억제할 수 있다.
• 이 약주제조법처럼 초기에 쌀알누룩을 이용해 약주를 제조할 경우, 초기에 미생물 오염의 위험이 낮을 것으로 생각된다. 또한 산이 높을 경우, 젖산균 번석이 어려워 젖산 생성을 억제할 수 있으므로, 산미 높은 술이 되는 것을 방지할 수 있을 것으로 판단되며 이는 발효기간 전체를 보아도 pH가 4.5이하를 유지함을 통해 확인이 가능했다.
• 담금단계에서는 pH, 총산이 큰 변화를 보인 반면, 5일 이후는 큰 변화는 보이지 않았다.
• 멥쌀과 찹쌀을 비교해보면, 큰 차이는 없으나 멥쌀이 찹쌀에 비해 산 함량이 좀 더 높은 것으로 나타났다.

3. 아미노산도, 알코올

• ( 아미노산도 ) 약주 발효 중 아미노산의 변화는 2단담금 후 지속적으로 증가하는 경향.찹쌀은 멥쌀보다 아미노산도가 더 높게 나타났으며, 후기로 갈수록 그 차이는 커짐.
• ( 알코올 ) 약주 발효 중 당의 감소와 함께 알코올은 계속적으로 증가. 3일차에는 1단 담금 때 넣은 원료로 인하여 잠시 알코올 함량이 감소하였지만 이후 지속적으로 증가함. 하지만, 7일 이후부터는 크게 증가하지 않았으며, 이는 당 함량이 크게 줄어들지 않은 것과 일치하는 경향.

1. 유기산

그림1. 약주 발효 중 유기산 변화

• 약주 발효 중 유리당은 주로 glucos가 존재하였음. 발효 4~5일 사이 glucose 함량이 감소하는 경향을 나타냈는데 이때 알코올 함량이 급격히 증가함을 통해 이시기에 알코올발효가 활방하게 진행됐음을 알 수 있음.
• 또한, 멥쌀보다 찹쌀을 이용했을 때, glucose 함량이 높음을 알 수 있었는데(4일차), 이후 멥쌀은 5일차에 급격히 감소한 반면, 찹쌀은 완만하게 감소하는 경향을 보임.
• 2단담금을 통해 유리당 함량은 급격히 증가함. 하지만, 6일 이후부터 멥쌀, 찹쌀 모두 유리당 함량은 증가하였는데 이를 통해 넣은 증자미는 효모가 크게 이용하지 못했음을 알 수 있음.

2. 유리당

그림2. 약주 발효 중 유리당 변화

• 쌀과 누룩을 주원료로 제조한 술에 함유되어 있는 유기산은 주로 효모에 의해 생성되어진다고 알려져 있으나, 발효 초기인 담금단계에 주로 존재하는 citric acid는 쌀알누룩에 의해 생성된 것으로 판단됨.
• 초기에 쌀알누룩을 이용함에 따라 citiric acid 함량이 높게 나타났으며, 2단 담금 후 급격히 감소하여 그 값을 유지하였음.
• 멥쌀과 찹쌀의 큰 차이는 없었으나, 찹쌀을 원료로 사용하였을 경우, 전반적으로 유기산 함량이 낮은 것으로 나타남.

1. 진균류

• 밑술을 담금 때 백국, 효모, 물, 증자미를 사용하는데 백국에서 Aspergillus luchensis, 효모의 Saccharomyces cerevisiae가 유래하였음.
• 1단 담금 전인 2일차까지는 당화효소를 낼 수 있는 Aspergillus luchencisis의 군집비율이 낮아지는 것을 확인할 수 있었음.
• 이에 1단 담금을 통해 백국을 더 첨가함에 따라 3일차에 Asp.luchensis가 더 증가

• 전반적으로 밑술에 존재하였던 Aspergillus, Saccharomycse 속이 주로 존재하고 있으나, 그 외의 미생물이 검출되었음.
• 이는 2단담금에서 넣어준 재래누룩에서 유래한 균으로 판단됨.

2. 세균류

• 밑술 단계에서는 세균이 존재하지 않았음.

1. pH 및 총산

• 총산은 2일차까지 급격하게 증가하여 0.3%의 값을 나타내고 7일차까지 유지.
• 이후 총산이 지속적으로 증가한 후 배양 30일차에 0.4%로 누룩의 배양기간이 경과함에 따라 꾸준히 증가하는 경향을 나타냄.
• 배양 초기 pH, 총산이 각각 급격하게 감소, 증가하였는데 이는 누룩 내에 젖산균이 생장하며 젖산을 생성하여 산이 증가한 것으로 생각됨.
• 14일차 이후부터 pH, 총산의 변화가 크지 않았으며 이 기간 동안 미생물군집의 비율도 크게 변하지 않은 것을 통해 배양기간은 14일을 넘기지 않아도 될 것으로 생각됨.

2. 아미노산도

• 누룩의 주원료인 밀에는 단백질이 존재하며 이는 배양기간 동안 미생물에 의해 생산되는 단백질 분해효소에 의해 아미노산으로 분해됨.
• 밀누룩 배양기간 중 아미노산도는 지속적으로 증가하여 7일차에 최댓값을 나타냈으며, 그후 감소하는 경향을 나타냈음.

1. 유기산

그림1. 밀누룩의 배양 경과에 따른 유기산 변화

• 유기산의 총합이 가장 높은 때는 4일차로 그 후 감소하는 경향.
• 유기산마다 다르지만 재래누룩이 배양되는 동안 증가하다 감소하는 경향을 나타냈음.
• 유기산 중 malic acid가 가장 많은 함량을 나타냈음.
• Lactic acid, succinic acid는 발효 초기에 소량 생성되었지만, 중기 전에 줄어듦.

2. 유리당

그림2. 밀누룩의 배양 경과에 따른 유리당 변화

1. 세균류

• 재래누룩의 Bacillus 속 비율은 배양기간 동안 서서히 증가하여 배양 7일차에 90.1%를 차지함.
• Bacillus 속이 배양기간 동안 우점하였으나 발효 7일차까지는 비율이 증가하였음.
• 발효 10일차에는 재래누룩 내부의 급격한 품온 상승을 방지하기 위해 발효실의 온도를 조절하였는데, 이때 Bacillus 속 비율이 66.1%로 감소하였으나 배양 30일차에 Bacillus 속이 다시 증가하여 86.8%를 차지함.

2. 진균류

• 배양기간에 따른 재래누룩의 진균류 군집 분석 결과 발효 초기에는 아직 밝혀지지 않은 미생물이 다량 존재.
• 이를 통해 아직 활용할 수 있는 미생물이 누룩에 아직 많을 것으로 예상됨.
• 재래누룩의 Rhizopus 속 비율은 배양 초기부터 서서히 증가하여 발효 5일차에 30.9%를 차지한 후 10일차까지 감소하여 17.6%를 나타냄.
• 동정된 균들 중 2일차부터는 Rhizopus 속이 우점하고 있었음.
• Aspergillus 속은 발효 초기에 0.1-0.2% 비율을 차지하였고, 발효기간이 경과됨에 따라 감소하는 경향을 나타냄.